High Throughput Antibody Production
高通量抗体生产
让 Twist 加快您的抗体筛选
在抗体开发流程中,研究人员在从生物淘選(biopanning)過渡到抗體表徵(Antibody characterization)时经常会遭遇瓶颈。噬菌体展示和單 B 細胞測序(single B-cell sequencing) 等技术具有高通量的特性,可以识别出成百上千种用於开发的潜在高亲和力抗体。要进一步研究这些抗体,需要以全长抗体的形式表达,这一过程通常是低通量的,会耗费大量资源,是进展过程中的一大障碍。
Twist 高通量抗体生产充分利用 Twist 在自動化 DNA 合成和抗體生產方面的專業知識,同时生产数千种不同的抗体用於筛选和研发,從而打破了這一瓶頸。Twist 可高通量生產 15 µg 至 2000 µg 的抗體,品質優良價格實惠,足以確定需要進一步研究的候選抗體。Twist 採用 HEK-293 瞬時表達系統(transient expression system),产量稳定、可重复(谤别辫谤辞诲耻肠颈产濒别)、可扩展(蝉肠补濒补产濒别)。由於表達量因抗體序列而異,因此 Twist 使用並報告對照序列的結果,確保轉染和蛋白質生產正常運轉。
HT IgG特點:
1. High throughput (高通量)
.同时产生数千个抗体基因
.灵活的规模,从数十个到数千个抗体
.快速的周轉時間(Turnaround time)
2. Customizable (可定製)
.抗体序列完全可定製
.使用 Twist 的载体或您自己選擇载体
.提供 VHH、scFv-Fc 和 IgG 亞型
3. One-stop-shop for precision (一站式精準服務)
.我們可處理 DNA 合成、克隆、表達和純化
.NGS 序列完美的基因,確保生產高品質抗體
.稳定的专案间(辫谤辞箩别肠迟-迟辞-辫谤辞箩别肠迟)一致性表达
下单流程
※ !
点击查看&苍产蝉辫;?
製作流程
簡而言之,Twist 可將重、輕或單鏈可變序列合成並克隆到含有 Fc 的载体中。然後將成對的重鍊和輕鍊或單鏈基因轉染到 HEK293 細胞中 4 天。收穫含有分泌抗體的上清液,並使用蛋白質 A/G 進行純化。分別使用 A280 和 digital CE-SDS 檢查純化抗體的濃度、大小和純度信息。
这个流程需要多长时间?
從序列提交到交付,1mL 和 8mL 抗體訂單的預計交付時間分別為 20-25 個工作日和 22-35 個工作日。
联络资讯
E-mail : specialist@abrealbiotech.com
Line ID : @abreal
让 Twist 加快您的抗体筛选
在抗體產生之後,純化抗體並測定產率。在產生的 518 個抗體中,有 482 種通過了大小和純度品質控制測試——409 種抗體的產量超過 100 ug。
产量稳定
LabChip 通過對樣本進行變性來分析每個純化樣品,以獲得大小和純度數據。運行十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳 (CE-SDS),根據梯度指標,獲得大小數據,從而確定近似分子量 (kDa) 以及重鍊和輕鏈的純度百分比。 7 kD 處的峰是染料顯色的起始位置。
可選擇载体 ()
Human IgG | VHH |
pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) | pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) |
pTwist CMV hIgG1(7777 bp) | pTwist CMV hIgG1-Fc(7495 bp) |
pTwist CMV hIgG2(7765 bp) | pTwist CMV hIgG2-Fc(7468 bp) |
pTwist CMV hIgG4 S228P(7768 bp) | |
pTwist CMV hIgK(7108 bp) | |
pTwist CMV hIgL2(7105 bp) |
※列表上都没有您想要的抗体吗?没关係词我们还有提供载体建置(Custom Vector Onboarding)服務!
1. 一管/盤您訂購的抗體
.規格:在 1 mL 或 8 mL 培養物中產生的抗體
.型式:纯化蛋白或上清液的型式提供
.提供IgG 的所有主要亞型:IgG1、IgG2、IgG4、Kappa 和Lambda 輕鏈,以及VHH-Fc(IgG1 和IgG2)
.產量:從15 μg 至2,000 μg 不等
.表達系統:使用HEK-293 細胞瞬時表達系統
2. QC 報告
.利用毛細管電泳十二烷基硫酸鈉 (CE-SDS) 測定法進行 A280 定量、大小 (kDa) 和純度百分比分析
3. 加購服務
.Carterra SPR Affinity Assessment
.UNCLE Stability Analysis
.SEC, % Monomer
常见问题
Q1: Twist 是否提供製備好的DNA以及已純化的抗體或上清液抗體?
A1:對於用於抗體生產的合成克隆基因,Twist 提供 clonal gene glycerol stocks。在抗體生產過程中,DNA 因轉染而消耗;但是,glycerol stocks 保存 DNA 並可與生產的抗體一同交付。請參閱從 glycerol stocks 中製備新鮮 DNA 的方案。
Q2: Leader (signal peptide) sequence 有什麼作用?我們在 pTwist 载体中使用了什麼 leader sequence?
A2:Leader or secretory signal sequence 在轉譯過程的早期充當細胞機制結合的肽信號(peptide signal)。這有助於將轉譯複合物(translation complex) 正確定位到內質網,在內質網中抗體鏈(antibody chains) 可以進入分泌途徑以進行蛋白質組裝和細胞分泌。Leader sequence在蛋白質組裝過程中會被切割,因此不會是最終蛋白質的一部份。 Twist 在 pTwist 载体上使用了以下的 leader sequences,這些序列已通過我們的 pTwist 载体進行了測試和驗證:
痴贬:惭碍贬尝奥贵贵尝尝尝痴础础笔搁奥痴尝厂
痴尝:惭痴尝蚕罢蚕痴贵滨厂尝尝尝奥滨厂骋础驰骋
Q3: Kozak 序列的作用是什麼?pTwist 载体中的 Kozak 序列是什麼?
A3:Kozak 序列將起始前複合體 (Pre-initiation complex, PIC) 和核醣體引導到轉譯起始位點(起始密碼子),並介導核醣體組裝,確保對正確的蛋白質序列進行轉譯 (translate)。
Kozak 序列通常被認為是GCCGCCACCATGG,其中 ATG 是起始密碼子。 Twist 使用起始密碼子 ATG 上游的縮寫版本 GCCACC。
蚕4:&苍产蝉辫;若交付型式為尘别诲颈补,应如何纯化抗体?
A4:您可以使用protein A或 protein G 固相進行純化,兩者可與抗體的 FC 區域結合,具體取決於 IgG 的種類和同種型。或者,您可以使用固定化抗原(全長或短肽抗原)來純化抗體。該方法將取決於抗體的下游應用及特異性。
蚕5:生产这些抗体用到的是什麼细胞株?
A5:HEK(人類胚胎腎臟)293 細胞(Expi-293)
Q6:我是否可以用客製化的 Fc 區域(如 IgG3 Fc、突變的 IgG 1 Fc)或小鼠等其他物種來製備抗體?
A6:當客戶想要使用自己的 Fc 區域序列(IgG3、小鼠 IgG 或修飾的Fc)或需要表達其他類型的 Fc 融合抗體時,可以選擇使用 pTwist CMV BG WPRE Neo 表達载体。
请记得在编码序列的末端放上一个终止密码子。
Q7:為什麼我們的 IgG constructs 中缺少 C-terminal lysine residues??
A7:研究表明,一旦 IgG 進入循環(circulation),重鏈的 C-terminal lysine residues?(存在於所有 IgG 同種型上)就會被切割掉。研究還表明,Lysine一旦被切割掉就不會對相關功能產生影響,而且它的存在實際上會抑制抗體充分發揮細胞毒性的潛力:
Q8:為什麼我們的 VHH-Fc 融合载体(fusion vectors) 中的第 10 個正電子(positon) cystein 會突變為 serine?
A8:這種 full IgG 中的 cystein 與 VHH-Fc 融合構建體中不存在的 LC 恆定區形成雙硫鍵。
Q9:如何上传我的抗体序列?
础9:请确保序列格式如下所示,以便上传可变区域:
- 去除 signal leader peptide(使用 pTwist 载体 + signal leader peptide)
- 可變區域不應以任何 CH1 起始序列結束
- 如果您的 ORF 與您的插入位點一致,序列可以分為三個
交付型式
Q1: Buffer exchange有哪些緩衝液選項?
A1:我們使用市售的 PBS
- PBS 7.4 Cat# 21-031-CM Corning
- PBS 6.0 Cat# P1760 Teknova
Q2: 如何檢測抗體的品質?
A2:Twist 在還原條件下檢測每種抗體產品的產量 (µg)、純度 (%) 和大小 (kDa)。每個抗體將通過 LabChip (CE-SDS) 進行檢測,以測定單個重鏈和輕鏈的純度和大小。產量根據 A280 讀數進行定量。上清液樣本使用滴度測定法(titer determination method) 進行定量。在最終文件中,除了純度百分比、重鏈和輕鏈大小外,還會報告每個純化抗體的體積、產量和濃度值。上清液記錄文件中將提供抗體滴度表達水平,包含低、中或高三個表達水平。
Q3: Twist 所提供的 elution 體積是多少? 1mL和8mL 的預期產量是多少?
A3:1 mL = ~220 uL volume, 15-300 ug
8 mL = ~550 uL volume, 15-3000 ug
Q4: 有哪些交付型式可選?
A4:96-deep well plates - custom plate maps available
1.4 mL micronic tube racks
2 mL tubes
10 mL tubes (for 8 mL supernatant only)
序列设计的资源和指导
- AbYsis 為一種或多種抗體提供了綜合、全面、帶註釋的序列評估。 AbYsis 提供了全面的抗體序列區域劃分,以快速確定可變區的起始和結束位點。此外,還以列表的形式提供了對 leader 序列、FWK 序列和 CDR 序列以及末尾序列或恆定區序列的劃分。
- 利用生物資訊學程序(bioinformatic programs) 可將 abYsis 提供的註釋應用於您的序列,有助於可視化和分離可變區。下面是導入到 Geneious Prime 軟體平台且應用了 abYsis 註釋的序列範例。
- 另外一個可提供 leader 序列、可變區和恆定區全面劃分的選項是 ANARCI。分析所得結果會以紅色突出顯示確切的可變區序列,接下來您可將此上傳到我們電子商務網站上的抗體應用程序。 ANARCI 還提供了有關輕鏈結構域類型和序列種類的詳細信息。
- 請記住,可變區序列絕不能以甲硫胺酸 (M) 開頭。如果您將上傳以胺基酸 M 或核苷酸 ATG 開頭的序列,並且計劃使用 pTwist 载体,請聯繫我們的人員尋求幫助。
- 考慮到雙硫鍵和其他特徵之間的差異,將可變結構域從一個物種重組到另一個物種可能會比較複雜。默認情況下,Twist eCommerce平台不會更正這些問題。通常需要您來考慮和檢查這些與重組相關的複雜問題。如果您需要幫助,請聯繫我們的團隊。
下单流程
※ !
点击查看&苍产蝉辫;?
製作流程
簡而言之,Twist 可將重、輕或單鏈可變序列合成並克隆到含有 Fc 的载体中。然後將成對的重鍊和輕鍊或單鏈基因轉染到 HEK293 細胞中 4 天。收穫含有分泌抗體的上清液,並使用蛋白質 A/G 進行純化。分別使用 A280 和 digital CE-SDS 檢查純化抗體的濃度、大小和純度信息。
这个流程需要多长时间?
從序列提交到交付,1mL 和 8mL 抗體訂單的預計交付時間分別為 20-25 個工作日和 22-35 個工作日。
联络资讯
E-mail : specialist@abrealbiotech.com
Line ID : @abreal
让 Twist 加快您的抗体筛选
在抗體產生之後,純化抗體並測定產率。在產生的 518 個抗體中,有 482 種通過了大小和純度品質控制測試——409 種抗體的產量超過 100 ug。
产量稳定
LabChip 通過對樣本進行變性來分析每個純化樣品,以獲得大小和純度數據。運行十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳 (CE-SDS),根據梯度指標,獲得大小數據,從而確定近似分子量 (kDa) 以及重鍊和輕鏈的純度百分比。 7 kD 處的峰是染料顯色的起始位置。
可選擇载体 ()
Human IgG | VHH |
pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) | pTwist CMV BG WPRE Neo(6842 bp) |
pTwist CMV hIgG1(7777 bp) | pTwist CMV hIgG1-Fc(7495 bp) |
pTwist CMV hIgG2(7765 bp) | pTwist CMV hIgG2-Fc(7468 bp) |
pTwist CMV hIgG4 S228P(7768 bp) | |
pTwist CMV hIgK(7108 bp) | |
pTwist CMV hIgL2(7105 bp) |
※列表上都没有您想要的抗体吗?没关係词我们还有提供载体建置(Custom Vector Onboarding)服務!
1. 一管/盤您訂購的抗體
.規格:在 1 mL 或 8 mL 培養物中產生的抗體
.型式:纯化蛋白或上清液的型式提供
.提供IgG 的所有主要亞型:IgG1、IgG2、IgG4、Kappa 和Lambda 輕鏈,以及VHH-Fc(IgG1 和IgG2)
.產量:從15 μg 至2,000 μg 不等
.表達系統:使用HEK-293 細胞瞬時表達系統
2. QC 報告
.利用毛細管電泳十二烷基硫酸鈉 (CE-SDS) 測定法進行 A280 定量、大小 (kDa) 和純度百分比分析
3. 加購服務
.Carterra SPR Affinity Assessment
.UNCLE Stability Analysis
.SEC, % Monomer
常见问题
Q1: Twist 是否提供製備好的DNA以及已純化的抗體或上清液抗體?
A1:對於用於抗體生產的合成克隆基因,Twist 提供 clonal gene glycerol stocks。在抗體生產過程中,DNA 因轉染而消耗;但是,glycerol stocks 保存 DNA 並可與生產的抗體一同交付。請參閱從 glycerol stocks 中製備新鮮 DNA 的方案。
Q2: Leader (signal peptide) sequence 有什麼作用?我們在 pTwist 载体中使用了什麼 leader sequence?
A2:Leader or secretory signal sequence 在轉譯過程的早期充當細胞機制結合的肽信號(peptide signal)。這有助於將轉譯複合物(translation complex) 正確定位到內質網,在內質網中抗體鏈(antibody chains) 可以進入分泌途徑以進行蛋白質組裝和細胞分泌。Leader sequence在蛋白質組裝過程中會被切割,因此不會是最終蛋白質的一部份。 Twist 在 pTwist 载体上使用了以下的 leader sequences,這些序列已通過我們的 pTwist 载体進行了測試和驗證:
痴贬:惭碍贬尝奥贵贵尝尝尝痴础础笔搁奥痴尝厂
痴尝:惭痴尝蚕罢蚕痴贵滨厂尝尝尝奥滨厂骋础驰骋
Q3: Kozak 序列的作用是什麼?pTwist 载体中的 Kozak 序列是什麼?
A3:Kozak 序列將起始前複合體 (Pre-initiation complex, PIC) 和核醣體引導到轉譯起始位點(起始密碼子),並介導核醣體組裝,確保對正確的蛋白質序列進行轉譯 (translate)。
Kozak 序列通常被認為是GCCGCCACCATGG,其中 ATG 是起始密碼子。 Twist 使用起始密碼子 ATG 上游的縮寫版本 GCCACC。
蚕4:&苍产蝉辫;若交付型式為尘别诲颈补,应如何纯化抗体?
A4:您可以使用protein A或 protein G 固相進行純化,兩者可與抗體的 FC 區域結合,具體取決於 IgG 的種類和同種型。或者,您可以使用固定化抗原(全長或短肽抗原)來純化抗體。該方法將取決於抗體的下游應用及特異性。
蚕5:生产这些抗体用到的是什麼细胞株?
A5:HEK(人類胚胎腎臟)293 細胞(Expi-293)
Q6:我是否可以用客製化的 Fc 區域(如 IgG3 Fc、突變的 IgG 1 Fc)或小鼠等其他物種來製備抗體?
A6:當客戶想要使用自己的 Fc 區域序列(IgG3、小鼠 IgG 或修飾的Fc)或需要表達其他類型的 Fc 融合抗體時,可以選擇使用 pTwist CMV BG WPRE Neo 表達载体。
请记得在编码序列的末端放上一个终止密码子。
Q7:為什麼我們的 IgG constructs 中缺少 C-terminal lysine residues??
A7:研究表明,一旦 IgG 進入循環(circulation),重鏈的 C-terminal lysine residues?(存在於所有 IgG 同種型上)就會被切割掉。研究還表明,Lysine一旦被切割掉就不會對相關功能產生影響,而且它的存在實際上會抑制抗體充分發揮細胞毒性的潛力:
Q8:為什麼我們的 VHH-Fc 融合载体(fusion vectors) 中的第 10 個正電子(positon) cystein 會突變為 serine?
A8:這種 full IgG 中的 cystein 與 VHH-Fc 融合構建體中不存在的 LC 恆定區形成雙硫鍵。
Q9:如何上传我的抗体序列?
础9:请确保序列格式如下所示,以便上传可变区域:
- 去除 signal leader peptide(使用 pTwist 载体 + signal leader peptide)
- 可變區域不應以任何 CH1 起始序列結束
- 如果您的 ORF 與您的插入位點一致,序列可以分為三個
交付型式
Q1: Buffer exchange有哪些緩衝液選項?
A1:我們使用市售的 PBS
- PBS 7.4 Cat# 21-031-CM Corning
- PBS 6.0 Cat# P1760 Teknova
Q2: 如何檢測抗體的品質?
A2:Twist 在還原條件下檢測每種抗體產品的產量 (µg)、純度 (%) 和大小 (kDa)。每個抗體將通過 LabChip (CE-SDS) 進行檢測,以測定單個重鏈和輕鏈的純度和大小。產量根據 A280 讀數進行定量。上清液樣本使用滴度測定法(titer determination method) 進行定量。在最終文件中,除了純度百分比、重鏈和輕鏈大小外,還會報告每個純化抗體的體積、產量和濃度值。上清液記錄文件中將提供抗體滴度表達水平,包含低、中或高三個表達水平。
Q3: Twist 所提供的 elution 體積是多少? 1mL和8mL 的預期產量是多少?
A3:1 mL = ~220 uL volume, 15-300 ug
8 mL = ~550 uL volume, 15-3000 ug
Q4: 有哪些交付型式可選?
A4:96-deep well plates - custom plate maps available
1.4 mL micronic tube racks
2 mL tubes
10 mL tubes (for 8 mL supernatant only)
序列设计的资源和指导
- AbYsis 為一種或多種抗體提供了綜合、全面、帶註釋的序列評估。 AbYsis 提供了全面的抗體序列區域劃分,以快速確定可變區的起始和結束位點。此外,還以列表的形式提供了對 leader 序列、FWK 序列和 CDR 序列以及末尾序列或恆定區序列的劃分。
- 利用生物資訊學程序(bioinformatic programs) 可將 abYsis 提供的註釋應用於您的序列,有助於可視化和分離可變區。下面是導入到 Geneious Prime 軟體平台且應用了 abYsis 註釋的序列範例。
- 另外一個可提供 leader 序列、可變區和恆定區全面劃分的選項是 ANARCI。分析所得結果會以紅色突出顯示確切的可變區序列,接下來您可將此上傳到我們電子商務網站上的抗體應用程序。 ANARCI 還提供了有關輕鏈結構域類型和序列種類的詳細信息。
- 請記住,可變區序列絕不能以甲硫胺酸 (M) 開頭。如果您將上傳以胺基酸 M 或核苷酸 ATG 開頭的序列,並且計劃使用 pTwist 载体,請聯繫我們的人員尋求幫助。
- 考慮到雙硫鍵和其他特徵之間的差異,將可變結構域從一個物種重組到另一個物種可能會比較複雜。默認情況下,Twist eCommerce平台不會更正這些問題。通常需要您來考慮和檢查這些與重組相關的複雜問題。如果您需要幫助,請聯繫我們的團隊。